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Como interpretar gráficos de citometria de fluxo?

A maioria dos dados de citometria de fluxo são apresentados em gráficos bidimensionais, como exemplo gráfico de pontos (dot plot), ou em gráficos unidimensionais, como exemplo histogramas.

Os histogramas podem ser utilizados para representar a fluorescência no eixo x e o número de eventos no eixo y.


Em dotplots, dois parâmetros são utilizados no gráfico. Parâmetros de fluorescência, tamanho (FSC – foward scatter) ou complexidade (SSC – side scatter) podem ser inseridos no eixo x e y. Estão listados abaixo alguns exemplos de parâmetros que podem ser utilizados em conjunto:

  • FSC vs. SSC

  • Fluorescência 1 vs. FSC ou SSC

  • Fluorescência 2 vs. Fluorescência 1


Os eixos x e y são uma escala de mensuração de intensidade de fluorescência. Os parâmetros SSC e FSC são comumente representados em uma escala linear e os parâmetros de fluorescência em uma escala logarítmica ou bi-exponencial. Desta forma, eventos com menor fluorescência estarão mais próximos da esquerda inferior de um gráfico, regiões mais próximas ao número zero da escala. Já eventos com maior fluorescência estarão próximos a direita superior de um gráfico.


Na figura abaixo é possível observar a partir da escala x e y quatro regiões delimitadas por uma gate de quadrante. Nesta separação, observamos que no quadrante esquerdo inferior estão presentes eventos duplo negativos para os parâmetros CD19 e CD8. No quadrante esquerdo superior estão presentes eventos simples positivos para o parâmetro CD19, já no quadrante direito inferior estão presentes eventos simples positivos para o parâmetro CD8. No quadrante superior direito ficariam eventos duplo positivos se existissem células CD19+ e CD8+.


Referências:

Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed. Nature Immunology, 2006.

Flow Cytometry Basics for the Non-expert. Springer, 2018.



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