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O que é uma estratégia de gating?

A estratégia de gating se refere a seleção sucessiva de subpopulações de células através de gates durante uma análise de citometria de fluxo. A análise usualmente é empregada para remoção de eventos com múltiplas células e células mortas, antes de sequencialmente identificar populações de células de interesse e posterior análise de marcadores que demonstrem seu estado de ativação.


Como exemplo, na figura é demonstrada a estratégia de gating após a seleção de células únicas e células viáveis. No primeiro dotplot é demonstrada a frequência de populações de células T CD8+, células B (CD19+) e células duplo negativas para estes dois marcadores. No segundo dotplot é representada as células duplo negativas identificadas no dotplot anterior, porém é possível identificar a frequência de células T CD4+ e neutrófilos (Ly6G+). Da mesma forma, no gráfico 3 é representada as células duplo negativas identificadas no dotplot 1, porém através da expressão de NK1.1 é possível identificar a frequência de células NK. No quarto gráfico, são representadas as células vindas da estratégia de gating de células únicas e células viáveis. Neste gráfico, através da análise da expressão de CCR2 e Ly6C é possível identificar a frequência de monócitos inflamatórios.



Usualmente esta análise é realizada manualmente baseando-se no conhecimento da literatura e características de expressão de moléculas pelas células. Porém, controles são necessários para certificar o posicionamento das gates e identificação de células positivas e negativas.


Estes controles são chamados de FMO (fluorescence minus one) e correspondem a tubos apresentando suas células e marcação para todos os marcadores do seu painel, porém com a ausência de um marcador. Desta forma, para todos os marcadores do seu painel, você deverá ter um tubo com todas os marcadores menos a adição dele.


Para você entender melhor, vamos usar este exemplo. Utilizando um painel com 3 marcadores, FITC, PE e APC, você deverá ter 3 controles FMO, cada um com a ausência de marcação de um marcador.



Caso não realize estes controles durante a sua análise de gating, você encontrará dificuldade em certificar e comprovar a identificação de células positivas para os marcadores analisados.


Referências: Guidelines for Gating Flow Cytometry Data for Immunological Assays. doi: 10.1007/978-1-4939-9650-6_5.

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