4. Unmixing depedent spreading (UDS)

Na citometria de fluxo espectral é utilizado um algoritmo matemático chamado unmixing para resolver e identificar o perfil de emissão espectral de fluorescência de cada fluorocromo que compõe uma marcação multiparamétrica. Esse procedimento matemático apresenta variações quando são inseridas variáveis altamente correlacionadas (fluorocromos muito similares) e essas variações resultam no unmixing-dependent spreading (UDS).

Podemos observar esse fenômeno na prática. Para aumentar a quantidade de parâmetros em nossos painéis de citometria de fluxo, atualmente é necessário incluir fluorocromos que apresentam maior similaridade entre si. Assim, um painel de 50 cores tende a apresentar maior unmixing-dependent spreading (UDS) (gráfico à direita) do que um painel de 20 cores (gráfico à esquerda). Quando aplicamos o unmixing do painel de 50 cores em um painel de 20 cores, fica evidente que o processo de unmixing é o responsável pelo UDS (gráfico central – Figura 1).

A spillover-spreading Matrix (SSM) ajuda a relevar quando o spillover-spreading error (SSE) irá contribuir com o unmixing-dependent spreading (UDS), mas não detecta outras manifestações que podem também influenciar o UDS.

De forma prática, Peter Mage, Andrew J. Konecny e Florian Mair desenvolveram a Hotspot Matrix que quantifica o impacto do unmixing-dependent spreading (UDS) em um painel de citometria de fluxo, ao mesmo tempo que identifica combinações problemáticas de fluorocromos que aumentam o UDS (Figura 2).

Neste sentido, a Hotspot Matrix deve ser utilizada no processo de design de painéis de citometria de fluxo espectral para avaliar combinações compatíveis de fluorocromos em relação ao seu impacto no Unmixing-dependent spreading (UDS) e consequentemente na resolução de marcações. No entanto, ela não substitui outras considerações existentes sobre o design de painéis, como a relação entre o brilho do fluorocromo e o nível de expressão do antígeno ou a relação entre a co-expressão de parâmetros e o spillover-spreading error (SSE).

Referências:

10.1101/2025.04.17.649396