6. Titulação

A titulação de anticorpos é um requisito fundamental para o desenvolvimento de um painel de citometria de fluxo espectral bem-sucedido. Definir a concentração ideal dos anticorpos é essencial para reduzir a ligação inespecífica e proporcionar uma melhor resolução entre populações positivas e negativas.

Além de reduzir o background, a redução da concentração do anticorpo além do melhor título, pode ser uma ferramenta para de reduzir a intensidade de sinal da fluorescência e assim minimizar o spillover-spreading error (SSE).

A titulação é realizada por meio do teste de marcação de uma amostra com concentrações do anticorpo inferiores às recomendadas pelo fabricante. Após a aquisição da fluorescência, determina-se a resolução da marcação através da formula matemática do stain index (figura 1).

As figuras 2 e 3 exemplificam o que ocorre na prática. O excesso de concentração de anticorpos pode acarretar aumento do background por marcação inespecífica. Nesses casos, ocorre o aumento da fluorescência da população negativa, tomando-a mais próxima da população positiva. Isso resulta em uma menor resolução e um stain index reduzido (mais a direita das figuras 2 e 3).

Com a diminuição da concentração dos anticorpo, é possível  identificar a concentração ótima de marcação, permitindo maior resolução. Nessa condição, observa-se melhor separação do sinal de fluorescência da população positiva em relação à negativa, assim com um stain index mais alto (região central das figuras 2). Note também que concentrações de anticorpos muito baixas também resultam em menor resolução (mais à esquerda da figura 2).

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