7. Controles adequados para realização do unmixing

Na citometria de fluxo espectral, é utilizado um algoritmo matemático chamado unmixing para resolver e identificar o perfil de emissão espectral de fluorescência de cada fluorocromo que compõe uma marcação multiparamétrica. Esse procedimento matemático é realizado por meio de controles chamados single stain (controles simples marcado).

Os controles simples marcados são tubos que contêm suas células de interesse ou beads de compensação marcadas apenas com um dos anticorpos que compõe seu painel de citometria de fluxo. Assim, se o seu painel tiver 20 parâmetros, será necessário preparar 20 controles simples marcado.

Como regra geral, controles de simples marcados realizados com as próprias células de interesse fornecem os melhores resultados no unmixing. A exceção ocorre quando um antígeno tem expressão muito baixa, causando sinal positivo insuficiente para servir de referência, tornando o controle simples marcado com beads de compensação a melhor opção.

Existem outras regras que devemos nos atentar. Abaixo estão cinco recomendações fundamentais para a preparação de controles de marcação simples (single stain) em citometria de fluxo espectral:

1.      O pico positivo no controle de simples marcado deve ser tão brilhante quanto ou mais brilhante que a amostra de interesse.

2.      O mesmo fluorocromo utilizado na amostra multimarcada deve ser utilizado no controle simples marcado.

3.      A autofluorescência da população positiva deve ser idêntica à autofluorescência da população negativa. Uma consideração especial é o controle de referência do corante de viabilidade. Células mortas são mais autofluorescentes do que células vivas. Usar células mortas coradas como positivo e células vivas não coradas como negativo viola essa regra, então mate uma porção de células, as divida-as em duas, marque metade (pico positivo) e não marque a outra metade (pico negativo).

4.      Há variação entre lotes de fluorocromos em tandem. Sempre utilize o mesmo lote para o seu controle simples marcado e para a sua amostra multimarcada.

5.      Fixadores, exposição à luz e calor podem afetar a fluorescência, especialmente em fluorocromos em tandem. Por isso, é muito importante que seja aplicado nos controles single stain, o mesmo procedimento de marcação realizado nas amostras multimarcadas, incluindo o uso dos mesmos tampões e condições de incubação.

Referência:

doi: 10.3389/fimmu.2021.768113