9. O controle FMO ajuda identificar problemas no painel

O controle fluorescence minus one (FMO) permite a definição precisa de onde gates devem ser inseridas nos gráficos de citometria de fluxo. Desta forma, pode ser determinada com mais precisão o que realmente é fluorescência e o que é background. O controle FMO é uma amostra que foi marcada com todos os reagentes do painel de citometria, exceto um. 

No exemplo, publicado por Perffeto e colaboradores, foi comparada células marcadas com anti-CD3 FITC (isto é, anticorpos monoclonais específicos para CD3 conjugados com o fluorocromo FITC), anti-CD4 PE, anti-CD8 Cy5 PE e anti-CD45RO PE-Cy7 com o controle de células não marcadas e com o controle FMO para CD4, que consiste em células marcadas com todos os anticorpos conjugados, exceto os anticorpos específicos para CD4 (Figura 1). Na figura, deve-se notar que quando a amostra não corada é utilizada como controle para determinar as populações de células CD4 positivas e negativas, este controle não é adequado, pois a gate fica muito abaixo do que realmente seria a população positiva. Desta forma, o resultado seria incorreto. No entanto, quando o controle FMO CD4 é utilizado como controle para determinar as populações de células CD4 positivas e negativas, as populações são identificadas corretamente através da gate, dando assim uma representação mais precisa da porcentagem da população que compreende células CD4 positivas.

Além disso, o FMO pode ser utilizado também para ajudar a identificar problemas no painel. Konecny e colaboradores realizaram um controle FMO com 5 fluorocromos a menos que o seu painel de 50 cores (fluorescence minus 5, FM-5), para avaliar como a adição desses 5 fluorocromos afetava o spillover-spreading error (SSE) e o desempenho geral do painel (Figura 2). Desta forma, o FMO também pode ser empregado para identificar fluorocromos que estejam impactando negativamente o desempenho de painéis high-parameter.

Referências:

doi: 10.1038/nri1416

doi: 10.1002/cyto.a.24841