2. Filtragem de dados
Série de postagens sobre análise de dados de citometria de fluxo.
2. Filtragem de dados
Após a remoção de eventos com anormalidades no processo de aquisição de dados de citometria de fluxo [postagem anterior]. O segundo pré-processamento consiste na filtragem dos dados através da exclusão de grumos de células (doublets), debris e células mortas (Figura 1). Esta filtragem garante a remoção de eventos que podem gerar resultados falso positivos em suas análises e diminuir a pureza de seus isolamentos por cell sorting.
A formação de doublets ocorre quando duas ou mais células que apresentam contato passam juntas ao mesmo tempo no ponto de interceptação com o laser. Podemos identificar doublets através da informação de um sinal gerado por células ao passar por um laser e promover a dispersão de luz, que é detectada no detector de tamanho, FSC (foward scatter). O sinal gerado consiste na informação de intensidade em volts em relação ao tempo de passagem da célula ao ponto de interceptação com o laser (Figura 2). Podemos extrair três informações deste sinal, como o tamanho máximo do sinal (H – height), tempo do sinal (H – height) e área do sinal (A – area).
Como representado na Figura 2, quando doublets passam no ponto de interceptação ele apresenta um aumento da área do sinal (FSC-A) e manutenção do tamanho do sinal (FSC-H) em comparação som singlets. Desta forma, para selecionamos células únicas (singlets) e excluirmos doublets, devemos fazer um gráfico bidimensional com os parâmetros FSC-H e FSC-A e não selecionarmos em um gate os eventos com maiores valores de FSC-A que não estão proporcionais a FSC-H (Figura 2).
Após a seleção de singlets, podemos identificar debris na região esquerda inferior de um gráfico bidimensional com os parâmetros SSC-A e FSC-A [debris podem ser identificados e removidos na mesma região, esquerda inferior, no gráfico com os parâmetros FSC-H e FSC-A, com foi feito na Figura 1]. Neste gráfico, devemos selecionar nossas populações celulares através de um gating e avaliar a sua viabilidade celular.
A viabilidade celular na citometria de fluxo é comumente determinada através da avaliação da integridade de membrana citoplasmática [aguarde mais explicações nas próximas postagens]. Desta forma, o último processo do pré-processamento que irá garantir qualidade as suas análises de dados de citometria é a seleção das populações de células viáveis.
Referência: DOI: 10.1038/s41598-020-64516-0
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